翹首期盼了近4年，終于等到研究成果了。
近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院盧鈾教授團隊在頂級期刊《自然·醫(yī)學(xué)》上發(fā)布最新研究成果[1]：使用CRISPR-Cas9編輯的T細胞在臨床上治療疾病是安全可行的。
這項研究成果再次證實了CRISPR基因編輯技術(shù)在臨床應(yīng)用中的安全性，為后續(xù)類似研究的開展奠定了基礎(chǔ)。
▲ 論文首頁截圖
盧鈾教授團隊發(fā)起的這項基因編輯臨床研究，其實是世界第一個CRISPR療法人體試驗，開始于2016年6月。
當時的情況是，大量的基礎(chǔ)研究證實，CRISPR-Cas9是一種方便、靈活、精確的基因編輯方法。但是CRISPR-Cas9在臨床應(yīng)用中的安全性還需臨床研究檢驗。
在CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)冉冉升起的時候，癌癥免疫療法也在蓬勃發(fā)展。阻斷PD-1/PD-L1通路的PD-1抑制劑，已經(jīng)成為PD-L1表達陽性的晚期非小細胞肺癌（NSCLC）的一線治療藥物。這一療法甚至能將患者的5年生存率提高到15.5%-23%[2]。
免疫療法的成功，讓盧鈾教授團隊想到：破壞T細胞的PD-1，然后將T細胞回輸給患者，對于晚期肺癌的治療可能也是有效的。
這個猜想一方面是基于免疫治療的基本邏輯，另一方面是基于當時已經(jīng)存在的兩個基礎(chǔ)研究：用鋅指編輯技術(shù)編輯T細胞的PD-1，可以增強T細胞對黑色素瘤細胞的毒性[3]；以及用CRISPR-Cas9破壞T細胞的PD-1，可在模式小鼠身上對抗胃癌[4]。
T細胞和腫瘤細胞之間的PD-1/PD-L1通路
基于以上的研究成果，盧鈾教授團隊在晚期肺癌患者中，開展了臨床研究。由于是首個人體臨床試驗，考慮到倫理學(xué)問題和脫靶突變的風險，他們在劑量遞增的I期臨床試驗中，只招募那些經(jīng)過多種療法治療之后依然無效的NSCLC患者。
在2016年8月26日到2018年3月21日之間，一共招募了22名患者。研究人員從患者體內(nèi)采集T細胞，然后用電穿孔的方法將CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)轉(zhuǎn)入T細胞中[5]，破壞PD-1基因的2號外顯子。
總體來看，基因編輯的效率在8.7%到31.2%之間，中值是20.1%。在編輯過的T細胞中，PD-1的表達水平明顯降低，PD-1的破壞率在33.7%到67%之間，中值是46.3%。
基因編輯T細胞的機制，及編輯效果
在招募的22名患者中，有5名患者因T細胞體外擴增不足，沒有接受治療，余下的17名患者均獲得了高活性（90%）的編輯后的T細胞。制備T細胞的中位時間是25天（17-40天）。
只不過，在回輸編輯過的T細胞之前，有2人疾病進展，1人肺部感染，1人類風濕關(guān)節(jié)炎加重，1人主動退出研究。最終有12人接受了T細胞的回輸治療。
接受治療的患者以28天為一個周期，分三次注射PD-1被編輯過的T細胞，直到患者疾病進展或者出現(xiàn)不能耐受的毒性為止，每位患者每次回輸T細胞的中位數(shù)是1.33億個。
試驗設(shè)計流程
從12位接受治療的患者來看，他們的T細胞中位編輯效率是5.81%。在所有被編輯的T細胞中。絕大部分是CD3陽性（中值99.1%），CD3和CD8雙陽性占比73.5%。
與未被編輯的T細胞相比，在被編輯過的T細胞中，CD8和IFN-γ雙陽性的占比顯著增加。這表明，破壞T細胞的PD-1之后，T細胞的活性增強了。
至于大家最關(guān)心的編輯脫靶率，研究人員也做了深入的研究。總體來看，中位脫靶率是0.05%，遠遠低于1.69%的中靶率。基于這個數(shù)據(jù)，研究人員認為，CRISPR-Cas9編輯T細胞是安全的。
具體來看，在主要的脫靶導(dǎo)致的突變中，會導(dǎo)致移碼變異的插入/缺失占比71.2%，不會導(dǎo)致移碼的插入/缺失占比28.6%，其他類型變異極少。還有一點值得一提的是，這些突變主要出現(xiàn)在基因之間（48.1%）或者內(nèi)含子（35.1%）區(qū)域，對基因功能的影響不大。
脫靶的情況分析
從安全性上來看，在12名接受治療的患者中，有1名患者沒有出現(xiàn)治療相關(guān)不良事件，其余11名患者發(fā)生了1/2級與治療相關(guān)的不良事件，例如淋巴細胞減少癥（3例）、疲勞（3例）、白細胞減少癥（2例）、發(fā)燒（2例）、關(guān)節(jié)痛（2例）和皮疹（2例）。
這就意味著沒有患者出現(xiàn)3級及以上的不良事件，而且沒有患者出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征。也就是說，CRISPR破壞T細胞的PD-1，作為一種治療策略是安全的。
治療相關(guān)的副作用
從治療的效果上看，在長達47.1周的中位隨訪時間內(nèi)，12名患者的中位無進展生存期（PFS）是7.7周，中位總生存期（OS）為42.6周。不過沒有患者獲得部分緩解，只有兩名患者病情穩(wěn)定。
截至2020年1月31日，所有患者出現(xiàn)疾病進展。在12名患者中，有11名（91.7％）死于腫瘤進展，所有患者的死亡均與治療無關(guān)。剩下的一名患者仍在接受其他治療。
患者的治療情況
基于以上數(shù)據(jù)，研究人員認為，他們的研究成果進一步支持了由CRISPR-Cas9技術(shù)進行的基因編輯T細胞療法在臨床上的安全性和可行性，這也與Carl June團隊近期發(fā)表的結(jié)果一致[6]。
至于大家擔心的脫靶效應(yīng)，一是脫靶率低，二是絕大多數(shù)發(fā)生在非編碼區(qū)，這不太可能對編碼基因產(chǎn)生重大影響。
雖然CRISPR-Cas9技術(shù)的臨床使用的長期安全性仍然需要關(guān)注，但是在本研究中，他們發(fā)現(xiàn)被編輯的T細胞壽命較短，因此他們認為永久性基因組改變的風險是有限的。
參考文獻
[1].https：//www.nature.com/articles/s41591-020-0840-5
[2].Garon E B， Hellmann M D， Rizvi N A， et al. Five-Year Overall Survival for Patients With Advanced Non?Small-Cell Lung Cancer Treated With Pembrolizumab： Results From the Phase I KEYNOTE-001 Study[J]. Journal of clinical oncology： official journal of the American Society of Clinical Oncology， 2019， 37(28)： 2518-2527.
[3].Beane J D， Lee G， Zheng Z， et al. Clinical scale zinc finger nuclease-mediated gene editing of PD-1 in tumor infiltrating lymphocytes for the treatment of metastatic melanoma[J]. Molecular Therapy， 2015， 23(8)： 1380-1390.
[4].Su S， Zou Z， Chen F， et al. CRISPR-Cas9-mediated disruption of PD-1 on human T cells for adoptive cellular therapies of EBV positive gastric cancer[J]. Oncoimmunology， 2017， 6(1)： e1249558.
[5].Su S， Hu B， Shao J， et al. CRISPR-Cas9 mediated efficient PD-1 disruption on human primary T cells from cancer patients[J]. Scientific reports， 2016， 6： 20070.
[6].Stadtmauer E A， Fraietta J A， Davis M M， et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer[J]. Science， 2020， 367(6481).
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